Quando há suspeita de síndrome de Klinefelter com base em exames clínicos e testes preliminares, o diagnóstico é confirmado por um teste de análise cromossômica realizado a partir de uma amostra de sangue periférico colhida do braço do paciente. Este teste envolve a análise das células sanguíneas para determinar a estrutura cromossômica, e a obtenção dos resultados pode levar um certo tempo. Embora 80-90% dos indivíduos com síndrome de Klinefelter tipicamente apresentem uma estrutura cromossômica 47,XXY, em casos restantes podem ser observados tipos mosaico mais raros, variantes ou anomalias estruturais do cromossomo X.