Cuando se sospecha el síndrome de Klinefelter basándose en el examen clínico y las pruebas preliminares, el diagnóstico se confirma mediante una prueba de análisis cromosómico realizada a partir de una muestra de sangre periférica tomada del brazo del paciente. Esta prueba implica el examen de las células sanguíneas para determinar la estructura cromosómica, y la obtención de los resultados puede llevar un tiempo determinado. Mientras que el 80-90% de los individuos con síndrome de Klinefelter suelen presentar una estructura cromosómica 47,XXY, en los casos restantes también se pueden observar tipos mosaico más raros, variantes o anomalías estructurales del cromosoma X.