Lorsqu'une suspicion de syndrome de Klinefelter est soulevée suite à un examen clinique et des tests préliminaires, le diagnostic est confirmé par un test d'analyse chromosomique réalisé à partir d'un échantillon de sang périphérique prélevé au bras du patient. Ce test implique l'examen des cellules sanguines pour déterminer la structure chromosomique, et l'obtention des résultats peut nécessiter un certain délai. Alors que 80 à 90 % des individus atteints du syndrome de Klinefelter présentent typiquement une structure chromosomique 47,XXY, des types mosaïques plus rares, des variantes ou des anomalies structurelles du chromosome X peuvent également être observés dans les cas restants.