Klinik muayene ve ön tetkikler sonucunda Klinefelter sendromu şüphesi oluştuğunda, tanı, hastanın kolundan alınan periferik kan örneği ile yapılan kromozom analizi testiyle kesinleşir. Bu test, kan hücrelerinin incelenerek kromozomal yapının belirlenmesini içerir ve sonuçların alınması belirli bir süre gerektirebilir. Klinefelter sendromlu bireylerin %80-90'ında tipik olarak 47,XXY kromozom yapısı saptanırken, kalan vakalarda daha nadir mozaik tipler, varyantlar veya yapısal X kromozom anomalileri de görülebilir.