Wenn aufgrund klinischer Untersuchung und Voruntersuchungen der Verdacht auf Klinefelter-Syndrom besteht, wird die Diagnose durch einen Chromosomenanalysetest bestätigt, der aus einer peripheren Blutprobe, die dem Arm des Patienten entnommen wird, durchgeführt wird. Dieser Test beinhaltet die Untersuchung von Blutzellen zur Bestimmung der Chromosomenstruktur, und die Ergebnisse können eine gewisse Zeit in Anspruch nehmen. Während bei 80-90 % der Personen mit Klinefelter-Syndrom typischerweise eine 47,XXY-Chromosomenstruktur festgestellt wird, können in den verbleibenden Fällen auch seltenere Mosaiktypen, Varianten oder strukturelle X-Chromosomenanomalien beobachtet werden.